مقایسه فعالیت-پایداری گلیکوزیل هیدرولازهای بومی ایران و بررسی افزایش کارایی به روش جهش زایی هدفدار

در این پروژه، مطالعاتی جهت بررسی فعالیت و پایداری حرارتی بر روی دو نوع آنزیم گلیکوزیل هیدرولاز به انجام رسید. ابتدا ژن کد کننده آنزیم آلفا-آمیلاز حاصل از باکتری بومی باسیلوس مگاتریوم who جداسازی شد. سپس به منظور تبیین نقش اسیدهای آمینه متصل شونده به کلسیم در پایداری حرارتی این آنزیم پنج جهش نقطه ای طراحی شد و به انجام رسید. آنزیم های جهش یافته، فعالیت هیدرولازی خود را حفظ کردند. از طرفی در حضور یون کلسیم تمایل آنزیم (انواع وحشی و جهش یافته) نسبت به سوبسترای نشاسته افزایش یافت. در مقایسه با آنزیم وحشی، یون کلسیم اثر مثبتی بر روی بازده کاتالیتیک بیشتر آنزیم های جهش یافته داشت. در جهش یافته های a53s، n75d، s76p و h77e وابستگی نیمه عمر آنزیم به غلظت یون کلسیم نشان داد که بهبود پایداری حرارتی آنها به علت اتصال افزایش یافته یون کلسیم می باشد. در مقابل، جهش یافته h58i، بدون وابستگی به کلسیم در مقابل حرارت پایدار شده است. در پایدارترین جهش یافته، تبدیل his-77 به گلوتامات منجر به افزایش 4 برابری نیمه عمر در دمای 65 درجه سانتیگراد و نیز افزایش دمای گذار ظاهری (t50) و دمای بهینه عملکرد آن به مقدار 9 و 4 درجه سانتیگراد به ترتیب، در مقایسه با آنزیم وحشی شد. بعلاوه پارامترهای ترمودینامیکی واکنش آمیلولیتیک و واکنش غیر فعال سازی حرارتی، افزایش انرژی فعال سازی سیستم را به میزان 4/1 برابر نشان داد. در این مطالعه نشان داده شد که یک جهش نقطه ای می تواند آلفا-آمیلازی مزوفیل را به آنزیمی پایدار، بدون از دست دادن قدرت کاتالیتیک آن در دماهای ملایم تبدیل کند. در مطالعه دیگری، آمیلوپلولاناز l14-apu از منشأ یک باکتری گرمادوست بومی ایران خالص سازی شده و اثر اکاربوز، به عنوان بازدارنده عمومی آلفا-آمیلازها، بر روی هیدرولیز نشاسته و پلولان توسط آنزیم مذکور مورد بررسی قرار گرفت. این بازدارندگی از نوع رقابتی بوده و ثابت بازدارندگی آن برای سوبسترای پلولان و نشاسته به ترتیب، 99 و 72 میکرومولار اندازه گیری شد. بررسی سرعت واکنش در سیستمی شامل انواع سوبستراهای رقابتی و الگوی بازدارندگی رقابتی اکاربوز در حضور سوبستراهای متفاوت، وجود یک جایگاه فعال برای دو فعالیت کاتالیتیک را پیشنهاد می کند. آنالیز اثر یونهای فلزی و سایر واکنشگرها نشان می دهد که یونهای ca2+، mg2+، mn2 و +co2، هر دو فعالیت آنزیم را افزایش داد در حالیکه n-بروموسوکسینامید منجر به غیرفعال شدن آنزیم شد. همچنین فعالیت آنزیم در حضور غلظت های اندک sds نیز افزایش یافت.